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耀世娱乐-耀世平台-洗蛋机【耀世注册登录】报道，葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)能从淀粉链的非还原末端逐个裂解α-1，4糖苷键，生成单一产物葡萄糖，广泛应用于淀粉生物精制中。原料淀粉糖化酶(RSGA)在淀粉糊化温度以下直接将生淀粉颗粒水解成葡萄糖，减少了高温蒸煮所需的能量消耗，简化了传统淀粉制糖的工艺流程。近年来，研究人员从黑曲霉、泡盛曲霉、黄曲霉等微生物种群中筛选和分离出了各种RSGA，它们可以作用于不同种类的生淀粉。这些RSGAs虽然可以降解生淀粉颗粒，但其最佳反应温度大多分布在65~75 ℃之间，对浓度为15%的生淀粉的降解率仅为10%。这还不足以使其大规模应用。因此，提高RSGA对生淀粉的催化效率迫在眉睫。
对RSGA的生淀粉降解活性的修饰较少，主要集中在融合酶的构建上。将黑曲霉糖化酶的淀粉结合域与酿酒酵母RSGA的C末端融合，使粗淀粉的降解活性提高约1倍。将酸性芽孢杆菌α-淀粉酶与黑曲糖化酶通过短肽融合，得到融合酶AMY-Glu，使玉米生淀粉的降解率提高了1.15倍。大量研究表明，N-糖基化对多糖水解酶的活性有重要影响。GH10家族的木聚糖酶在去除3个糖基化位点的糖链后，比活力下降了20%。在纤维二糖水解酶中，糖基化位点Asn137的存在使酶活提高了40%。在65位引入糖基化位点后，内切葡聚糖酶对CMC-Na和β-D-葡聚糖的催化活性分别提高了1.31倍和1.27倍。一般认为，额外的糖链可以促进酶和多糖底物之间的动态相互作用，从而进一步提高酶分子对底物的亲和力；此外，连接低聚糖和N-糖基化位点的共价键可以调节糖蛋白的能量景观，导致动力学性质的改变，因此，增加N-糖基化修饰可能是提高RSGA降解活性的新途径。
在以往的研究中，作者成功地在巴斯德毕赤酵母中表达了烟曲霉RSGA(afRSGA)，发现糖基化对其活性有重要影响。突变株Q113T的最适反应温度降低了10 ℃，并且通过113位饱和突变获得了催化活性较高的突变株Q113M。最后，根据分子动力学数据分析了提高催化活性的机理。
理性设计糖基化位点提高afRSGA的催化活性
大量研究表明，Asn-Xaa-Ser/Thr基序中的天冬酰胺残基(Xaa是除Pro以外的任何氨基酸)在真核生物中都可以糖基化。氨基酸序列分析表明，烟曲霉A1163的afRSGA含有13个Asn残基，其中Asn422(Asn-Gly-Ser)和Asn610(Asn-Arg-Ser)具有糖基化的序列特征。Asn下游i位的i+2位残基被Ser/Thr取代，以匹配糖基化基序(Asn-Xaa-Ser/Thr)。用NetNGlyc 1.0服务器评估突变序列N-糖基化的可能性。Asn44、Asn99、Asn111、Asn137、Asn172、Asn188和Asn209具有较高的糖基化潜力。糖基化预测参数和突变位点的序列安排如表1所示。对潜在糖基化位点的分析发现，它们集中在afRSGA的催化域(图1)。其中，Asn44、Asn172和Asn188位于α-螺旋中，Asn99、Asn111、Asn137和Asn209位于连接α螺旋的环中(图1)。突变体在毕赤酵母中表达，完成N-糖基化修饰，镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白。以玉米粗淀粉为底物，在pH 4.6和40 ℃条件下分析了afRSGA及其突变体的比活。如图2所示，与afRSGA相比，突变体G101S(对应于糖基化位点Asn99)和Q113T(对应于糖基化位点Asn111)的比活分别提高了1.19倍和1.21倍。其他突变株G101T和Y174T的活性升高，而突变体L190T的活性显著降低。139位和211位到苏氨酸/丝氨酸的突变导致活性降低。同样，G265T突变体不利于提高生淀粉的降解活性。在此基础上，为了进一步提高玉米粗淀粉的催化活性，构建了G101S/Q113T复合突变体。结果表明，粗淀粉的比活是afRSGA的1.22倍(图2)。
afRSGA及其突变体的糖基化分析
纯化的afRSGA和突变体用Endo H处理去糖基化。SDS-PAGE分析表明，afRSGA及其突变体在其上方出现一条主带和涂抹带，经内切酶处理后转化为一条相对分子质量均一的条带(68 kDa)，表明发生了脱糖基化反应。在afRSGA、D139T和D139S的情况下，转换的单带的分子质量与主带的分子质量大致相同(图3)。对于其余的突变体，经Endo H处理后，主带的分子质量略高于单带的分子质量(图3)，这表明在afRSGA中最初存在的糖基化之外还有额外的糖基化。其中，突变体M211S和M211T与afRSGA相比显示出分子质量范围更宽的涂抹条带(图3)。由于比活的提高，对afRSGA、G101S和Q113T进行了MALDI-TOF/MS的分子质量分析，G101S和Q113T的主带分别比afRSGA大2.13和0.92 kDa。因此，根据分子大小的差异和对GlyProt的分析，推测Man9GlcNAc2(2.1 kDa)和Man3GlcNAc2(0.98 kDa)分别连接在Asn99（G101S）和Asn111（Q113T）上。为了研究残基替换的作用，在大肠杆菌中表达了afRSGA、G101S、Q113T和G101S/Q113T，并对其进行了亲和纯化。突变体的比活相对低于afRSGA。这些结果表明，糖基化而不是残基突变在G101S、Q113T和G101S/Q113T的催化反应中起积极作用。
N-糖基化对afRSGA酶性质及反应动力学的影响
以可溶性淀粉为底物，测定了afRSGA和糖基化突变体的酶性质和动力学参数，以进一步评价N-糖基化的效果。在不同反应温度(30−80 ℃)下处理10 min后，测定酶的活性。与afRSGA相比，突变体Q113T的最适反应温度从70 ℃降至60 ℃，而G101S的最适反应温度保持在70 ℃(图4A)。此外，G101S/Q113T联合突变体的最适反应温度降至60 ℃。为了确定其热稳定性，将afRSGA及其糖基化突变体在60 ℃下孵育120 min。在培养过程中，每隔20分钟测定一次剩余酶活(图4B)，突变体G101S在60 ℃培养40分钟后仍保持70%的酶活力，t1/2为110分钟，比afRSGA(78分钟)高41%。此外，G101S的Tm比afRSGA高2.81 ℃(表2)。而Q113T和G101S/Q113T组合突变体在培养120 min后，酶活力下降近90%，t1/2分别只有27 min和25 min。因此，与afRSGA相比，两个突变体的Tm降低(表2)。此外，还对40 ℃、pH 4.6条件下的可溶性淀粉与酶的反应进行了动力学分析。G101S、Q113T和G101S/Q113T的kcat/Km值分别是RSGA的1.15、1.55和1.37倍(表2)。Km值较低时，突变体Q113T和G101S/Q113T显著提高了对可溶性淀粉的亲和力，而G101S没有显著影响。